課程內(nèi)容

《土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)》
兩個主要目的：
（1）從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌
（2）統(tǒng)計每克土樣樣品中究竟含有多少這樣的細菌。
CO(NH2)2+H2O—（脲酶）→CO+2NH3
（一）篩選菌株
水生耐熱細菌Taq
耐高溫的Taq DNA聚合酶
美國微生物學(xué)克布魯克
1966年發(fā)行耐熱細菌
根據(jù)水生耐熱細菌Taq篩選過程，P22旁欄思考？
選擇培養(yǎng)基
在微生物學(xué)中，將允許特點種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。
（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目
統(tǒng)計菌落數(shù)目的理論依據(jù)
當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落。來源于樣品稀釋液中的一個活菌。因此，恰當(dāng)?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計菌落數(shù)目的關(guān)鍵。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，通常將幾個稀釋度下的菌液都涂布在平板上，培養(yǎng)后再選擇菌落數(shù)在30~300的平板進行計數(shù)。
兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)。在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為10%的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。
1、第一位同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230.
2、第二位同學(xué)在該濃度下涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分布為21、212和256，該同學(xué)以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計結(jié)果。
你認(rèn)為哪位同學(xué)的結(jié)果接近真實值？你認(rèn)為這兩位同學(xué)的實驗需要改進嗎？如果需要，如何改進？
說明設(shè)置重復(fù)組的重要性：第一位同學(xué)只涂布了一個平板，沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說服力，第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問題，涂布了三個平板，但是，其中1個平板的計數(shù)結(jié)果與另2個相差太遠，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤。因此，不能簡單地講3個平板的計數(shù)值用來求平均值，這個實例啟示學(xué)生，在設(shè)計實驗時，一定要涂布至少3個平板，作為重復(fù)組，才能增強實驗的說服力與準(zhǔn)確性，在分析實驗結(jié)果時，一定要考慮設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實驗。
注意：統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低，這是因為當(dāng)兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來表示。顯微鏡直接計數(shù)也是測定微生物數(shù)量的常用方法。
每克樣品中的菌株數(shù)＝（C÷V）×M
C：某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)
V：涂布平板時所用的稀釋液的體積（ml）
M：稀釋倍數(shù)
（二）設(shè)置對照
在本課題的實驗時，A同學(xué)從對應(yīng)10^6倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落。但是，其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇大約50個菌落。
其他同學(xué)認(rèn)為A同學(xué)的結(jié)果有問題。他們分析可能是A同學(xué)的培養(yǎng)基被雜菌污染了，或者培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)，因而導(dǎo)致不能分解尿素的細菌也能在該培養(yǎng)基上生長。
但是，A同學(xué)確信自己的實驗操作準(zhǔn)確無誤，與其他同學(xué)的結(jié)果之所以不相同，是因為自己所選用的土壤樣品不同。但是，A同學(xué)在設(shè)計實驗的時候并沒有設(shè)置對照，因而此時也拿不出令同學(xué)們信服的證據(jù)。
你能通過設(shè)置對照，幫助A同學(xué)排除上述兩個可能影響實驗結(jié)果的因素嗎？
究竟是哪個原因，可以通過實驗來證明，實驗方案有兩種。一種方案是可以由其他同學(xué)用與A同學(xué)一樣的土壤進行試驗，如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。另一個方案是將A同學(xué)配置的培養(yǎng)基在不加同土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染，通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。
實驗設(shè)計
[一]土壤取樣
從肥沃、溫潤的土壤中取樣，先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。
[二]樣品的稀釋
樣品的稀釋程度將直接影響平板上生長的菌落數(shù)目，實際操作中。通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在30-300之間，適于計數(shù)的平板。
測定土壤中細菌的數(shù)量，一般選用10^4，10^5，10^6倍的稀釋液進行平板培養(yǎng)；測定放線菌的數(shù)量，一般選用10^4，10^5，10^6倍稀釋；測定真菌的數(shù)量。一般選用10^4，10^5，10^6倍稀釋，根據(jù)這些數(shù)據(jù)。請你思考胖欄中的問題。
當(dāng)你第一次做這個實驗的時候，可以得到稀釋的范圍放寬一點。例如，可以得10^5-10^5倍的稀釋液分布涂布到平板上培養(yǎng)，以保證能從中選擇出菌落數(shù)在30-300間的平板進行計數(shù)。
[三]微生物的培養(yǎng)與觀察
不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間，細菌一般在30-37℃的溫度下培養(yǎng)1-2d；放線菌一般在25-28℃的溫度下培養(yǎng)5-7d，而霉菌一般在25-28℃的溫度下培養(yǎng)3-4d，本實驗中，我們可以每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果。這樣可以防止因培養(yǎng)時間不是而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。
一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下（相同的培養(yǎng)基，溫度及培養(yǎng)時間），同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。
操作提示
[一]無菌操作
1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌
2、應(yīng)在火焰旁稱取土壤，在火焰附近將你稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞
3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作
[二]做好標(biāo)記
注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期，平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等
[三]規(guī)劃時間
結(jié)果分析
1、結(jié)合對照、分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落
2、是否獲得了某一稀釋度下，菌落數(shù)目在30--300的平板，在這稀釋度下，是否至少有兩個平板的菌落數(shù)相近？
3、你統(tǒng)計的每克土壤中含有分解尿素的細菌的菌落數(shù)是多少？與其他同學(xué)的結(jié)果接近嗎？如果差異很大，可能是什么原因引起的？
課題延伸
PH升高指示劑（酚紅）將變紅
CO(NH2)2+H2O—脲酶→CO2+2NH3
（一）空氣中微生物總數(shù)的檢測
（二）水中細菌總數(shù)的檢測
（三）牛奶中細菌的分離與計數(shù)
（四）土壤中真菌（或放線菌）的分離與計數(shù)